研究人員使用DQ-BSA (一種僅在溶酶體中降解時(shí)發(fā)光的物質(zhì)) 處理野生型 (WT) 和敲除型 (KO) hMGLs，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，與WT對(duì)照組相比，SORL1 KO hMGLs的溶酶體降解能力下降。起初研究人員懷疑這是由于溶酶體酶活性降低所致。但由于整體溶酶體蛋白表達(dá)未受影響，研究人員轉(zhuǎn)而尋找其他解釋，重點(diǎn)研究缺乏SORLA的細(xì)胞中的活性變化。

溶酶體水解酶從高爾基體 (TGN) 運(yùn)輸?shù)饺苊阁w的過(guò)程可通過(guò)一種由非依賴陽(yáng)離子的甘露糖-6-磷酸受體 (CIMPR) 和多蛋白復(fù)合體retromer調(diào)控的途徑實(shí)現(xiàn)。為了確定SORLA缺失是否干擾該功能，研究人員使用針對(duì)溶酶體酶 (如cathepsin B、cathepsin D和HEXB) 的抗體，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)分析測(cè)量它們與TGN和晚期內(nèi)體/溶酶體標(biāo)記物的共定位情況。

結(jié)果顯示，SORL1 KO hMGLs與TGN標(biāo)記物TGN38的共定位增加，而與溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1的共定位減少，表明溶酶體酶從TGN到溶酶體的運(yùn)輸出現(xiàn)錯(cuò)誤。接下來(lái)，研究人員研究了運(yùn)輸?shù)鞍證IMPR，以確定SORLA缺失如何導(dǎo)致這些酶滯留在TGN中。通過(guò)共定位實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡分析，他們發(fā)現(xiàn)KO hMGLs中CIMPR表達(dá)降低，與LAMP1的共定位也減少。

綜合數(shù)據(jù)表明，SORL1敲除的hMGLs中，CIMPR依賴的運(yùn)輸途徑受損。

該實(shí)驗(yàn)隨后評(píng)估了在 SORL1 敲除的人類小膠質(zhì)細(xì)胞（hMGLs）中，溶酶體內(nèi)吞噬的底物是否因溶酶體分解代謝減少而積累。測(cè)量了熒光團(tuán)標(biāo)記的淀粉樣蛋白β 1-42 纖維（fAb）和染料標(biāo)記的突觸體的積累，發(fā)現(xiàn)缺乏 SORLA 的細(xì)胞中這些物質(zhì)增加。在用氯喹抑制分解代謝時(shí)，野生型（WT）和敲除型（KO）細(xì)胞均表現(xiàn)出這些底物積累增加。為了檢查 KO 細(xì)胞中積累是否與吞噬攝取增加有關(guān)，研究人員再次將它們與fAb、染料標(biāo)記的突觸體以及 StressMarq 的淀粉樣蛋白β 1-42 寡聚體（目錄號(hào) SPR-488）共同孵育。有趣的是，KO細(xì)胞對(duì)突觸體和纖維的攝取增加，但對(duì)寡聚體沒(méi)有增加，揭示吞噬作用的增加可能與底物特異性相關(guān)。吞噬細(xì)胞表面受體TREM2 和 P2Y6 在 SORL1 KO hMGLs 上顯示出細(xì)胞表面定位增加，表明 SORLA 維持細(xì)胞表面最-佳的吞噬受體水平。因此得出結(jié)論：吞噬底物的攝取增加和降解減少是導(dǎo)致SORL1 KO hMGLs 溶酶體功能障礙和壓力的關(guān)鍵因素。

圖1. 淀粉樣蛋白β 1-42 寡聚體(目錄號(hào) SPR-488)的透射電子顯微鏡(TEM)成像。

由于研究人員發(fā)現(xiàn) CIMPR 調(diào)控的運(yùn)輸途徑在 SORL1 KO hMGLs 中受損，他們進(jìn)一步研究了溶酶體外排(LE)這一替代途徑是否能緩解溶酶體壓力。LE途徑是一個(gè)鈣依賴過(guò)程，使溶酶體能夠與質(zhì)膜融合并將其內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外環(huán)境。此外，該途徑至關(guān)重要，因?yàn)樗剐∧z質(zhì)或其他免疫細(xì)胞能夠在響應(yīng)外部刺激時(shí)釋放促炎細(xì)胞因子和溶酶體酶，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。Mishra等人發(fā)現(xiàn)該途徑在SORL1 KO hMGLs中也受損，加上KO細(xì)胞中溶酶體酶活性整體下降，導(dǎo)致細(xì)胞外酶活性水平降低。在接受促炎刺激 (如IFNγ或LPS) 后，SORL1 KO hMGLs也表現(xiàn)出多種促炎和抗炎細(xì)胞因子的分泌減少。

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